作者：麦子
KEGG是通路数据库中最庞大的，涵盖基因组网络信息，主要注释基因的功能和调控关系。当我们选到了合适的候选分子，单变量研究也已做完，接着研究机制的时便可使用到它。
你需要了解你的分子目前已有哪些研究，跟其他分子是怎样的关系。当然可以从文献中慢慢去了解，但KEGG绘制了已知的通路数据，直观呈现，无疑是提升检索效率好的办法。
KEGG的主要用途有：查询通路信息、信号通路检索，以及非常推荐的分析工具KEGG Mapper，它可以根据前期筛选得到的差异分子列表去构建分子调控网络，得到清晰简明的通路图。
咱们通过五个案例，来把这些功能用法撸一遍。
（好了我承认这是酸菜老师布置的作业，我又陪大家做作业来了）
作业一
请使用KEGG检索人类基因PTEN的信息并查看其参与了哪些信号通路，查看其在p53信号通路中的位置。
先找到网页下方的KEGG GENES子数据库。
在弹出的页面中，三个检索栏都可以用，不过推荐用第三个，比较准确简洁。不过注意格式，“物种 : 基因”
接着就有个弹窗显示该基因的信息，包括其参与的信号通路，其中就有我们要找的p53信号通路。
点击通路编号“hsa04115”，就可看到信号通路图，我们查询的PTEN基因被红色标注了出来。如果要查找该通路中的其他基因，也可以在本页面的搜索框中输入相应关键词，同样得到红色高亮显示。
作业二
查看KEGG中参与信号转导的信号通路，并点击mTOR信号通路，查看其关联的信号通路及调控的表型。
在KEGG首页上选择KEGG PATHWAY子数据库。
在点开后的页面往下拉到信号转导通路，相当多了。
找到mTOR信号通路，点进去。圆角矩形文本框中的就是其相关联的信号通路。
我们可以看到，mTOR上游有AMPK、MAPK、Insulin、PI3K-AKT等信号通路，各通路之间又有交互影响。
mTOR通路可以影响微管组织、脂解作用、脂类合成、自噬、蛋白合成、细胞骨架、细胞存活等表型，其中自噬、甘油酯代谢、actin细胞骨架调控在本数据库里有通路图谱。
作业三
请分析以下分子（人源）参与了哪些信号通路，并在信号通路中用粉红色标记表达下调的分子，用黄色标记表达上调的分子，给出基因匹配最多的信号通路图。
不同数据库对基因的识别码不一样，而KEGG只支持三个数据库的识别码，即KEGG、NCBI、Uniprot，所以要进行转换。现在有26个基因，那么批量转换比较便捷的方法是用Uniprot的在线工具。
在http://www.uniprot.org/ 点Retrieve/ID mapping进入如下页面，贴上自己的基因名，下方选择输入和需要输出的识别码类型，填好物种信息，就可点“Go”转换。
在弹出的页面中选择Reviewed的结果，再选择下载格式（Excel、非压缩）；也可以点旁边的Columns选择我们需要的列名。Entry即Uniprot编码。
下载好后，将Entry贴到我们原来的表格中。此处注意输入的THOA基因没有检索到Uniprot ID，舍去；另又有两个FAS，得到了不一样的Entry，那是因为输入的是基因缩写，可能检索到同缩写的多个基因。这时本来需要根据全称确认哪个是我们需要的，不过这次题目中没有说明，就全都要了吧，表达值也算一样的。
接下来用Excel的筛选工具，对表达值一列筛选。先选出<0者，新建一列填上pink；再选>0者，填上yellow。
注意颜色名称都要小写，否则KEGG识别不出来。
然后到KEGG主页，在最下方的分析工具里找到KEGG Mapper：
在新页面中选择Search & Color Pathway：
然后填好物种、ID格式，把刚才的Entry和颜色贴进来，点Exec查询。
搜出来一个相当长的列表，通路名后边的小括号内数字，就是该通路中含有我们查询的基因的数量。
按要求选择匹配最多的那个，点开就是我们需要的通路图了，匹配基因、上调下调一目了然。
作业四
根据所给的芯片结果数据，分析差异变化从大到小排列，前50个分子参与的信号通路，给出匹配度最高的信号通路图（要求用橙色orange标记上调基因，用青色cyan标记下调基因）
我们从生信公司拿到了芯片数据，要先做个预处理。找到变化倍数（Fold Change, FC）绝对值，按降序排列。
再找到EntrezGeneID，排除空值。
再在Excel上方的“数据”菜单中找到“删除重复项”，弹窗中选择EntrezGeneID，确认。
把前50个贴到另一个表里，仅留EntrezGeneID和Regulation两列，根据要求将上调下调的分别赋予颜色。然后按刚才查询通路的办法再操作一遍就好了，不过注意这回的输入格式是NCBI-GeneID。
然后点开匹配度最高的通路就是了。
作业五
在GEO数据库中检索到GSE18842，并使用GEO在线工具分析该数据集中tumor和control组间差异表达的分子，并用KEGG Mapper进行通路分析，给出匹配度第2的通路，并用颜色标记：红色标记上调倍数[4, ∞)；粉红色标记上调倍数在(0, 4)；蓝色标记下调倍数(-∞, -4]；青色标记下调倍数在(-4, 0)。
这里主要讲讲GEO数据库的检索和简单分析，后边的步骤跟之前的差不多了。GEO涵盖很多疾病的高通量数据，多个学科的小伙伴都可以应用。
打开我们熟悉的Pubmed，选择GEO Dataset，输入关键字GSE18842，Search。
进入相应的条目页面后，拉到下方点Analyze with GEO2R。
进入分析后，要先按数据提供的信息分配组别。点开上方的Define groups，分别输入组名Control和Tumor。然后按Title排序，选中所有control样本，再点一次Control组名，即可看到最左Group一列填上了相应的组名。同样的方法分配好Tumor组。
然后拉到下方点Top 250，默认分析结果仅显示变化最明显的250个分子（按p值排序）。我们也可以点Save all results，后续再按变化倍数排序，自己筛选所需的数量。
然后在新页面中点Select Columns，弹窗里选上Gene ID。
此时若点开单个基因，可以看到它在各样本中的表达情况。
收起柱状图，把数据复制贴到Excel表里。然后对GeneID一列去除重复值和空白值，剩下的将logFC和GeneID复制到一个新表格中。
我们还会发现一种情况，即有些探针是指向一个分子组合，这些通常是一个家族中的不同成员，用“///”分隔。而KEGG中需要一个分子单独一行，所以也要处理一下。
就手动把后面的分子贴到新插入的一行吧……变化倍数也复制下来，耐心点。
后边筛选数值、标记颜色、搜索通路的操作都会了吧？跟前边讲的一样哦。只是提醒一点，这里的logFC是FC以2为底数取的对数，所以题目中的上调倍数[4, ∞)的区间，是指logFC的[2, ∞)。
我们还是按要求选匹配第2的。
贴上结果图，细胞周期信号通路里多个分子被上调4倍以上。
欲知更多骚操作，欢迎来围观科研技能单元课~
往期链接：
欢迎投稿
tougao@helixlife.com.cn
合作微信：helixlife6