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最近小薇收到一些咨询慢病毒包装相关的审稿意见咨询，正好汇总给大家一起来了解了解这块知识。

还有个更仔细的审稿意见，例如这样的：

上面两条审稿意见都是对慢病毒包装的方法部分的一些细节问题，如果之前对慢病毒包装实验原理和步骤不是那么了解的情况下，可能回答这些问题就还是有些吃力的。

今天小薇就给大家一起来再重温一下慢病毒载体的一些相关基础知识吧~后续内容会更精彩，欢迎持续关注和转发~

为什么要进行慢病毒包装？

在细胞相关的实验操作中，对于一些用常规方法难以转染的细胞，通常通过慢病毒感染的方式将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而增加转染效率，并能够在细胞系中稳定表达若干代，可进行稳定细胞株的筛选。慢病毒载体具有能稳定表达外源基因、感染谱广泛、有效感染处于分裂期和静止期的细胞等优点。

图1 慢病毒包装过程（Bio Protoc. 2018 Nov 5;8(21):e3073.）

如上图所示，慢病毒包装过程一般为构建慢病毒表达载体、大量扩增慢病毒载体、在293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装、慢病毒的浓缩及纯化、慢病毒滴度测定。

如果有需求的小伙伴们可直接查看图一的文献中提供的整个慢病毒包装的实验材料和步骤，可供大家参考。不过现在许多公司都会合成已经做完滴度测定的现成的慢病毒包装载体，不需要自己再动手做这部分。但自己的实验还是需要了解清楚的，这样才可以解决上面审稿人的一些具体的实验细节问题。

慢病毒载体的迭代更新具体如何？

慢病毒载体来源于病原体HIV-1，如何增加该载体的生物安全性一直贯穿于整个载体的改造历史。

第一代慢病毒载体包括三质粒：

图2 第一代慢病毒包装（Biochem. J. (2012) 443, 603–618 (Printed in Great Britain) doi:10.1042/BJ20120146）

一个穿梭质粒：携带目的基因

一个包膜质粒：表达VSV-G

一个包装元件质粒：具有CMV强启动子，表达gag/pol以及各种辅助蛋白。

包装元件质粒与包膜蛋白质粒删掉了LTR和包装信号，避免它们被包装进入慢病毒载体颗粒中，降低了制备中复制型慢病毒（RCL）产生的可能性。

第二代慢病毒载体也包括三质粒：

图3 第二代慢病毒包装（Biochem. J. (2012) 443, 603–618 (Printed in Great Britain) doi:10.1042/BJ20120146）

第二代慢病毒载体包装系统删除了Vif、 Vpu、 Vpr 和Nef四个基因。加上用VSV-G取代HIV-1的env，第二代慢病毒载体只包含了HIV-1 的9个基因中的4个：gag、pol、tat、rev。第二代在第一代的基础上，又提高了安全性。

穿梭质粒包含病毒LTR和ψ包装信号。如果不提供内部启动子，基因表达将由5'LTR驱动，5'LTR是弱启动子，需要提供tat才能激活表达，正因为如此，第二代慢病毒穿梭质粒必须与第二代包装系统一起使用。

第三代慢病毒载体包括四质粒：

图4 第三代慢病毒包装（Biochem. J. (2012) 443, 603–618 (Printed in Great Britain) doi:10.1042/BJ20120146）

到了第三代又双叒叕升级了，将包装质粒分成了两个，一个编码rev，另一个编码gag和pol。tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率），所以第二代或第三代包装系统能够包装第三代穿梭质粒。第三代慢病毒系统比第二代系统更安全，但更难用，因为要用四个单独的质粒转染才能包出有功能的慢病毒颗粒。

所以总结一下，要想包出一个完整病毒，我们一般需要如下几个质粒：

①一个穿梭质粒；②一个或两个包装质粒；③一个包膜质粒。

然后把这几个质粒共转进293T细胞，包装后的病毒将会被释放到上清液中，收集病毒上清液经浓缩后（也可以不浓缩，直接用上清液），就可以感染我们的目的细胞了。

如何进行慢病毒包装？

1. 首先进行载体构建（过表达、干扰）；

2.然后将包装慢病毒过程中需要用到的三质粒（根据实际情况选取质粒）进行高纯度无内毒素抽提；

3.细胞的选择及铺板：小薇选用的是293T细胞进行慢病毒的包装，良好的293T细胞状态是病毒包装的首要关键因素，细胞代数不宜超过30代。首先，第一天胰酶消化293T细胞，血球计数板计数，用新鲜的DMEM完全培养基重悬细胞，按适当比例将细胞铺于10cm平皿中，每皿培养基体积为10ml，置于37°C，5%CO2培养箱中培养，待第二天转染前细胞密度达到80%-90%即可；

4. 第二天进行质粒转染，按一定比例将穿梭质粒、包装质粒、包膜质粒（不同的质粒采用的比例有所不同，需要进行摸索）溶于1500μl的opti-MEM中，轻柔混匀后，室温放置5min；将转染试剂PEI同样溶于1500μl的opti-MEM中，轻柔混匀后，室温放置5min；将静置5min后的质粒和转染试剂轻柔混合，室温放置20min，然后将混合液加入到培养皿中，轻轻混匀，不要将细胞吹起，置于37°C，5%CO2培养箱中培养；

5. 6-8h后，吸弃培养皿中的培养基，加入20mL新鲜的低血清DMEM培养基，置于37°C，5%CO2培养箱中继续培养；

6. 72h后，收细胞上清于50ml离心管中，用0.45μm滤器过滤；

7. 将病毒原液装进专用离心管中，利用超高速低温离心机进行浓缩，弃上清，静置2-3min左右，吸走多余液体，加入1mlOPTI-MEM溶解病毒沉淀，收集于1.5ml EP管中，置于4°C溶解过夜，溶解好后立即将病毒液分装，保存于-80°C。

看完这些基础知识和实验操作过程，是不是就完全可以去写回复信解决审稿人的疑虑啦~

下一期咱们来聊一聊慢病毒滴度检测的那些事儿~

有问题欢迎随时来撩~